Leveranciers-login
Home
BLIJF OP DE HOOGTE
Ontvang onze nieuwsbrief en digitale magazine
Uw adres wordt nooit aan derden doorgegeven.
Lees onze privacyverklaring.

   

ARTIKEL
Deel dit artikel
CRISPR-Cas kansrijke veredelingstool
Download dit artikel als pdf
Is uw adres bekend, dan wordt de pdf meteen geopend, anders krijgt u een link toegestuurd.
Ook ontvangt u onze volgende nieuwsbrief.

CRISPR-Cas kansrijke veredelingstool

De toevoeging van CRISPR-Cas aan de biotechnologische gereedschapskist heeft het wetenschappelijk en toegepast onderzoek de afgelopen jaren enorm versneld en gezorgd voor tal van nieuwe mogelijkheden. De Wageningse hoogleraar John van den Oost, een van de grondleggers van de techniek, legt uit hoe CRISPR-Cas werkt en waar het eigenlijk vandaan komt. CRISPR-Cas is zo langzamerhand niet alleen voor biotechnologen een ingeburgerde term.
CRISPR-Cas is zo langzamerhand niet alleen voor biotechnologen een ingeburgerde term, zeker sinds de ophef rondom de Chinese CRISPR-baby’s november 2018, die dankzij CRISPR-Cas immuun zijn tegen hiv. Hoewel de discussie over de veiligheid van CRISPR-Cas nog gaande is, is de techniek al niet meer weg te denken uit het wetenschappelijke en toegepaste onderzoek. Bacteriële virusafweer Oorspronkelijk is CRISPR-Cas een natuurlijk systeem dat bacteriën gebruiken om zich te wapenen tegen virussen. John van den Oost en collega-onderzoekers ontdekten in 2001 in het genoom van een bacterie een groot aantal repeterende stukjes DNA, de repeats, met daartussen stukjes variabel DNA, de spacers. Samen werden dit CRISPRs genoemd: Clusters of Regular Interspaced Short Palindromic Repeats. Later bleek dat dit een bacterieel immuunsysteem is. Als een bacterie wordt geïnfecteerd door een virus, wordt een deel van het virus-DNA in stukjes geknipt en ingebouwd in het bacteriële genoom als een nieuwe spacer binnen de CRISPR. Bij een nieuwe infectie kan de bacterie dankzij die spacer een virus herkennen. Deze spacer wordt dan overgeschreven als CRISPR RNA, waarna een Cas-enzym met behulp van dit stukje RNA het overeenkomstige virus-DNA opzoekt, om dat vervolgens kapot te knippen. Volle gereedschapskist Dit bacteriële afweersysteem bleek heel goed bruikbaar als gereedschap voor genetische modificatie. In de praktijk bestaat CRISPR-Cas uit een Cas-enzym met een stukje gids RNA (gRNA), dat de sequentie bevat van het DNA dat geknipt moet worden. Cas-enzymen bestaan in verschillende soorten en maten. De meest bekende variant is Cas9, maar er wordt ook wel gewerkt met Cas3 en Cas12. Elk Cas-enzym heeft weer een iets andere werkwijze. Cas3 knipt het DNA bijvoorbeeld volledig kapot, terwijl Cas9 een enkele breuk genereert op een specifieke locatie. Het belangrijkste verschil tussen alle Cas-enzymen is hun PAM-sequentie, een korte DNA-sequentie die aanwezig moet zijn om het DNA te kunnen knippen. Van den Oost legt uit: “Deze PAM-sequentie heeft vooral te maken met het oorspronkelijke doel van CRISPR-Cas: de virusafweer. De enzymen moeten natuurlijk alleen het virus-DNA knippen, en niet de overeenkomstige CRISPR in het bacteriële genoom.” Een dergelijk auto-immuunprobleem kan worden voorkomen doordat Cas-enzymen DNA alleen knippen als de PAM-sequentie aanwezig is. Daar is bij virus-DNA wél sprake van, maar bij het bacteriële genoom niet. “In geval van Cas9 is dat NGG aan de achterkant van het DNA-fragment, waarbij N elk nucleotide mag zijn. In geval van Cas12 moet er TTN zitten aan de voorkant van het DNA-fragment. Daar moet je bij toepassingen dus rekening mee houden. De kans is groot dat een van beide sequenties wel voorkomt in de buurt van het DNA waar je een verandering wilt introduceren. Bovendien worden er gelukkig steeds meer varianten van Cas-enzymen ontdekt met andere PAM- sequenties”, vertelt Van den Oost. Zelf werkt hij aan een nieuwe variant die goed bestand is tegen hoge temperaturen. “Die hebben we ooit gevonden in een composthoop in Ede.” Nauwkeurige of slordige reparatie “Wanneer een Cas-enzym met het gids-RNA de gewenste plek op het DNA heeft opgespoord en daar vervolgens een knip heeft aangebracht, is de rol van CRISPR-Cas zelf eigenlijk uitgespeeld. Wat er daarna gebeurt, hangt af van de reparatiesystemen die beschikbaar zijn in de cel”, vervolgt Van den Oost. Dit kan gebeuren door middel van homologe recombinatie, waarbij een geknipt gen heel nauwkeurig wordt gerepareerd, of door niet-homologe recombinatie, een vrij slordig systeem waarbij fouten kunnen worden gemaakt. “Het homologe systeem heeft natuurlijk de voorkeur, maar dat kun je helaas niet sturen. Het verschilt per celtype wat er beschikbaar is. Gistcellen en bacteriën hebben alleen homologe recombinatie, terwijl bij humane cellen dat systeem alleen beschikbaar is net voordat een cel gaat delen”, zegt Van den Oost. Vandaar dat er ondertussen wordt gewerkt aan een alternatief systeem dat base editing wordt genoemd. Hierbij wordt de nuclease-activiteit van het Cas-enzym geïnactiveerd, waardoor het enzym nog wel de juiste locatie op het genoom kan opzoeken, maar dit zelf niet meer kan knippen. Tegelijkertijd is er echter een tweede enzym aan het Cas-enzym gekoppeld dat het DNA wel heel nauwkeurig kan repareren. “Het nadeel is alleen dat er op dit moment nog maar een beperkt aantal omzettingen mogelijk is, alleen van C naar T en van A naar G. Aan andere omzettingen wordt nog gewerkt. Als dat lukt, kan dit een heel efficiënt systeem worden”, verwacht Van den Oost. Bijdrage aan de discussie Van den Oost ontving in het najaar van 2018 de Spinozapremie voor zijn onderzoek naar CRISPR-Cas. Met het toegekende geldbedrag wil hij naast zijn onderzoek ook een bijdrage leveren aan de discussie over CRISPR-Cas, met name in het kader van toepassingen voor voeding en gewassen. Vorig jaar besloot het Europese hof dat CRISPR-Cas gewassen onder dezelfde regelgeving vallen als GMO-gewassen. “Ik kan me daar echt over opwinden”, zegt Van den Oost. “Als je een wilde tomaat vergelijkt met de tomaat die bij de groenteboer ligt, dan is één tot twee procent van het genoom verschillend, oftewel tien tot twintig miljoen baseparen. Onderzoekers hoefden met CRISPR-Cas maar zes genen te veranderen in een wilde tomaat om een tomaat te krijgen die er hetzelfde uitziet als de tomaat in de winkel, in totaal maar twintig tot dertig baseparen. CRISPR-Cas heeft dus juist het voordeel dat je veel minder hoeft te veranderen, en bovendien weet je precies wat er gebeurt.” Van den Oost is daarom begonnen met lezingen voor biologieleraren en studenten en voorlichting op scholen om zo bij de basis te beginnen en uit te leggen dat de techniek veel voordelen heeft. De winst van CRISP-Cas in toegepast wetenschappelijk onderzoek Bio-ethanol uit landbouwafval Jean-Marc Daran, onderzoeker bij de afdeling Industriële microbiologie aan de TU Delft kan dankzij CRISPR-Cas een stuk sneller varianten maken van gist. “Dankzij CRISPR-Cas kunnen we nu in vivo site-directed mutagenese doen. Dat betekent dat we in levende cellen losse nucleotides kunnen veranderen. Zo kunnen we bijvoorbeeld mutaties creëren die we ook in de natuur tegenkomen of een patroon van mutaties creëren dat nodig is voor een bepaalde functie”, vertelt Daran. Daran gebruikt de bekende bakkersgist Saccharomyces cerevisiae als model voor zijn onderzoek. “Eigenlijk heeft CRISPR-Cas in ons onderzoek niet echt gezorgd voor een revolutie, maar het heeft het onderzoek wel versneld. Waar we voorheen soms vier jaar voor nodig hadden, kunnen we nu doen in een half jaar, zelfs als het gaat om heel moeilijke mutaties. Dat is voor ons de belangrijkste verandering. Dat komt vooral doordat we nu meerdere dingen tegelijk kunnen doen. We kunnen nu bijvoorbeeld in één stap meerdere genen weghalen en toevoegen, terwijl we dat vroeger in een aantal opeenvolgende stappen moesten doen. CRISPR-Cas opent voor ons ook de mogelijkheid om met andere gistsoorten te werken. Het gaat dan om minder conventionele soorten, die eerder te moeilijk waren om genetisch aan te passen. Nu is dat wel mogelijk, en dat is fascinerend in ons onderzoeksveld”, vertelt Daran. Daran werkt ook veel samen met bedrijven. “We ontwikkelen niet echt producten, maar onderzoeken mogelijkheden die later in industriële stammen kunnen worden toegepast”, vertelt hij. Een voorbeeld daarvan is de ontwikkeling van een giststam die kan groeien op andersoortige suikers, namelijk pentoses, zoals xylose en arabinose. Normale Saccharomyces cerevisiae kan deze suikers niet verwerken, terwijl deze pentoses juist veel voorkomen in gehydrolyseerde lignocellulose uit plantafval. De industrie zou dat graag gebruiken om bio-ethanol van te maken. “Dit onderzoek loopt al sinds 2002, toen CRISPR-Cas nog niet beschikbaar was, waardoor we de mutanten dus op andere manieren moesten maken. Met CRISPR-Cas zou dat nu dus een stuk sneller kunnen.” Niels Geijsen, hoogleraar regeneratieve geneeskunde bij het Hubrecht Instituut in Utrecht, doet onderzoek naar erfelijke spierziektes. CRISPR-Cas opent de mogelijkheid om de genetische afwijkingen daadwerkelijk te herstellen. Geijsen doet onderzoek naar de Duchenne spierdystrofie en facioscapulohumerale dystrofie (FSHD). “Bij de eerste aandoening zit het probleem door heel het lichaam, bij de tweede met name bij de spieren in schouder, bovenarmen en het gelaat, en in een later stadium ook andere spieren. Bij de ziekte van Duchenne was al bekend dat je met bepaalde genetische aanpassingen van de ziekte kunt herstellen. Het probleem is alleen dat je alle spiercellen in het lichaam dan moet behandelen. Daar hebben we nu nog geen goede methode voor. Bij FSDH speelt dat minder, omdat dat een lokaal probleem is. Het is dan wel de uitdaging dat het betreffende gen niet uniek is, het komt op meerdere locaties in het genoom voor. Vandaar dat we nu kijken of we dit misschien meer downstream via andere genen kunnen aanpakken, genen die door het eerste gen worden beïnvloed”, vertelt Geijsen. De veiligheid van CRISPR-Cas is daarbij nog wel een punt van zorg, zeker nu steeds meer bekend wordt dat door CRISPR-Cas miljoenen baseparen kunnen verdwijnen. Geijsen werkt aan een mogelijke oplossing. Hij heeft zelf een alternatieve methode ontwikkeld om CRISPR-Cas als eiwit de cel in te brengen, in plaats van het DNA dat codeert voor CRISPR-Cas, waardoor het veel korter in de cel aanwezig is en dus minder tijd heeft om ook op andere plekken in het DNA te knippen. Geijsen verwacht dat daardoor het aantal bij-effecten al een stuk minder zal zijn. “Daarnaast is het belangrijk om de bij-effecten goed in kaart te brengen”, zegt hij. “Dat kan ook, want het zijn geen willekeurige effecten, ze zijn redelijk voorspelbaar. Misschien dat we uiteindelijk een zekere mate van bij-effecten wel moeten accepteren, zeker bij een invaliderende dodelijke ziekte zoals Duchenne. Niets doen is ook een lastige keus.” Ruud de Maagd, onderzoeker bij Wageningen Plant Research, doet onderzoek naar de regulatie van groei en rijping van vruchten. Dankzij CRISPR-Cas kan hij veel nauwkeuriger te werk gaan om genen uit te schakelen. “Wij gebruiken tomaat als modelgewas, waarbij we CRISPR-Cas gebruiken om genen uit te schakelen, met name trans- criptiefactoren, om te zien wat hun functie is. In het verleden deden we dat met spontane mutanten of RNA-interferentie. Dat had als nadeel dat het lastig was om een gen volledig uit te schakelen of een specifiek gen uit te schakelen als er meerdere genen waren die veel op elkaar leken. Met CRISPR-Cas gaat dat veel beter, we kunnen nu veel preciezer werken”, vertelt De Maagd. CRISPR-Cas heeft het onderzoek helaas nog niet veel sneller gemaakt. “We kunnen wel met veel minder planten en daarmee minder werk en ruimte toe, omdat we al in een vroeger stadium weten welke de gewenste planten zijn. Desondanks hebben nog altijd een half jaar nodig vanaf het begin van de transformatie tot het moment dat we rijpe vruchten hebben. Dat komt vooral omdat we tussendoor planten uit weefselkweek moeten genereren. Ik wil in de toekomst kijken of we de mutagenese ook in de groeiende plant kunnen doen, zodat we de weefselkweek kunnen overslaan. Dat zou veel tijd schelen. Bij Arabidopsis is dat al mogelijk, maar bij andere planten nog niet.” Naast dit fundamentele onderzoek houdt De Maagd zich bezig met onderzoek naar meer praktische toepassingen. Ook daar wordt CRISPR-Cas breed ingezet. “We kijken bijvoorbeeld hoe we de productie van suiker in de tomaat kunnen aanpassen, om de smaak te verbeteren. We proberen ook de houdbaarheid te verbeteren, zodat de tomaat minder snel zacht wordt. Daarnaast kijken we naar de tomatenplant zelf. Voor telers zou het bijvoorbeeld fijn zijn als een plant minder zijtakken heeft, omdat ze die anders handmatig moeten weghalen.”
MAXUS MEDIA
LABinsights.net LABinsights.de LABinsights.nl
Ontvang onze nieuwsbrief
Nieuwsbrief archief
Volg ons
Linked
MAGAZINE
Abonneren
SERVICE EN CONTACT flag